HALO™ SARS-2 Direct PCR kit
(Кат.№ H-SARS2-d)
НАЗНАЧЕНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ
Тест-система «HALO SARS-2» предназначена для выявления РНК коронавируса COVID-19 методом одностадийной ОТ-ПЦР c детекцией результатов в режиме «реального времени» в лабораторной клинической практике.
Тест система «HALO SARS-2» предназначена для использования квалифицированными лабораторными работниками в соответствии с установленными региональными нормативами.
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ
Тест-система «HALO SARS-2» является высокочувствительной тест-системой для выявления РНК: лимит детекции составляет 5 геном-эквивалентов в реакции ОТ-ПЦР.
Тест-система «HALO SARS-2» обладает высокой диагностической устойчивостью к мутациям вируса за счет использования 2 различных мишеней в геноме вируса: ORF1ab и ген N.
В тест-системе «HALO SARS-2» значительно снижен риск ошибки оператора на всех этапах работы за счет использования идентичных и простых протоколов тест-систем серии «HALO»
В тест-системе «HALO SARS-2» используется быстрый протокол амплификации, который позволяет за 80–90 мин получить достоверные результаты исследования, что существенно повышает поточность лабораторных анализов.
Тест-системы «HALO SARS-2» с эндогенным ВКО позволяет проводить анализ качества забора биологического материала.
Комплектация тест-системы «HALO SARS-2» с эндогенным ВКО рассчитана на проведение 100 реакций и указана в таблица 1.
Результат амплификации РНК возбудителя регистрируется на канале HEX/Yellow, результат амплификации внутреннего контроля регистрируется на канале FAM/Green.
| Компонент | Количество / Объем |
| 1. ОТ-ПЦР-реагент | 1 пробирка – 0.5 мл |
| 2. Праймеры COVID-19 | 1 пробирка – 1.5 мл |
| 3. ПКО | 1 пробирка – 0.2 мл |
| 4. ОКО | 1 пробирка – 1.0 мл |
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
При работе с тест-системой необходимо соблюдать текущие ТНПА в области лабораторной клинической ПЦР-диагностики.
ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ
– амплификатор с детекцией результатов в режиме «реального времени»;
– ПЦР-бокс;
– центрифуга/вортекс;
– набор дозаторов переменного объема;
– одноразовые наконечники с фильтром для дозаторов переменного объема;
– одноразовые полипропиленовые закрывающиеся пробирки объемом 1,5–2,0 мл;
– оптические пробирки для ПЦР-РВ, адаптированные для используемого амплификатора;
– штативы для пробирок и наконечников;
– холодильник от +2 °С до +8 °С с морозильной камерой от минус 24 °С до минус 16 °С;
– отдельный халат и одноразовые перчатки;
– емкость для сброса наконечников;
– комплект средств для обработки рабочего места.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Подготовка образца и экстракция РНК
В качестве клинического материала используются мазки из носоглотки и ротоглотки помещенные в физраствор или PBS. Отбор образцов производится в соответствии с существующими ТНПА. Перед отбором мазков не допускается проведение гигиенических процедур носоглотки и ротоглотки (в том числе чистка зу-бов, полоскание и т.п.), а также
обработка медицинскими препаратами. Не допускается замораживание об-разцов. Перед постановкой ПЦР образцы необходимо встряхнуть.
Подготовка ПЦР-смеси
0. Разморозить все реагенты (при необходимости), перемешать (перевернув пробирки несколько раз) и сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
I. В каждую постановку амплификации помимо исследуемых образцов (N) должны входить 2 контрольных образца:
отрицательный контроль ПЦР (К-), положительный контроль ПЦР (К+)
В пробирке объемом 1,5-2 мл приготовить «Мастер Микс»:
5*(N+1) мкл ОТ-ПЦР-реагента + 15*(N+1) мкл праймеров
Где N – общее количество реакций амплификации с учетом контрольных образцов.
II. Перемешать «Мастер Микс» путем 5-ти кратного переворачивания пробирки, осадить кратковременным центрифугированием и внести по 20 мкл в пробирки для проведения ПЦР.
III. В подготовленные пробирки добавить по 5 мкл исследуемых мазков.
IV. Поставить контрольные реакции амплификации:
1) К- – внести в пробирку 5 мкл ОКО;
2) К+ – внести в пробирку 5 мкл ПКО.
| Компонент | Объем |
| Мастер Микс | 20 |
| Образец / Контроль | 5 |
| Общий объем | 25 |
Герметично закрыть пробирки крышками. В случае наличия пузырьков в растворе или капель на стенках пробирок
– удалить кратковременным центрифугированием.
Настройка инструмента
1. I.Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в амплификатор.
2. II.В соответствии с инструкцией к прибору запрограммировать амплификатор согласно
таблице 2.
Таблица 2. Параметры амплификации
| Этап | Температура °С | Время | Количество циклов |
| Обратная транскрипция | 55 | 10 мин | 1 |
| Начальная денатурация | 95 | 2 мин | 1 |
| Денатурация | 95 | 5 сек | 45 |
| Отжиг / Детекция (FAM/HEX) | 60 | 15 сек | 45 |
| Элонгация | 67 | 15 сек | 45 |
III.В соответствии с инструкцией к прибору запрограммировать положение пробирок в амплификаторе. Также
допускается выполнять данный шаг во время проведения амплификации или по ее окончанию, если это позволяет
программное обеспечение прибора.
IV. Дать название эксперимента и сохранить его на диске (в этом файле будут автоматически сохраненырезультаты
данного эксперимента). Запустить амплификатор*.
*Для приборов «Rotor-Gene» перед запуском выбрать функцию: «Perform Calibration Before 1st Acquisition/Perform Optimization Before 1st Acquisition/Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции». Для всех каналов установить параметры «Min Reading/Миним. Сигнал» – 5Fl и «Max Reading/Максим. Сигнал» – 10Fl.
Анализ результатов
I.Перед началом анализа необходимо задать настройки в соответствии с инструкцией к прибору.
а) для приборов типа «Rotor-Gene»*:
–установить значение параметра выбросов («NTC threshold/Порог Фона») – 5%. При необходимости по-рог фона может быть изменен в диапазоне 0–30 %**;
–установить значение параметра пороговой линии («Threshold/Порог») – 0,02. При необходимости порог может быть изменен в диапазоне 0,02–0,2**;
–при необходимости допускается активация функций «Dynamic tube/Динамич.фон» и «Slope Correct/Кор-рек. Уклона».
б) для приборов «Bio-Rad CFX96»*:
–установить значение параметра пороговой линии («Single Threshold») – 50. При необходимости порог может быть изменен в диапазоне 25–500**;.
Интерпретация оригиналов
| значение CT | Результат |
| <40 | Детекция (+) |
| ≥40 или нет результата | Нет детекции (-) |
Контроль качества
В случае несоответствия контрольных точек К- и К+ необходимо провести повторное исследование всех образцов начиная со стадии постановки ПЦР.
Таблица 4. Оценка результатов анализа контрольных точек
| Контрольная точка | Контролируемый этап анализа | Значение «Сt» по каналу FAM/Green | Значение «Сt» по каналу HEX/Yellow |
| К- | ПЦР | – | – |
| К+ | ПЦР | + | + |
4. Интерпретировать результаты ПЦР-анализа исследуемых образцов в соответствии с таблицей 5.
Таблица 5. Интерпретация результатов образцов
| Результат образца | Значение «Сt» по каналу HEX/Yellow | Значение «Сt» по каналу FAM/Green |
| Положительный | + | +/– |
| Отрицательный | – | + |
| Невалидный | – | – |
«–» обозначает отсутствие значения «Сt», график амплификации не пересекает пороговую линию
«+» обозначает наличие значения «Сt», график амплификации пересекает пороговую линию
«+/–» – значение «Сt» для данного канала не анализируется.
В случае сомнительного или не валидного результата требуется повторно провести ПЦР-исследование соответствующего образца начиная с этапа экстракции РНК или со стадии забора материала у пациента.
Повторный сомнительный результат считается отрицательным и не требует перестановки. Повторный невалидный результат свидетельствует о некачественном отборе клинического материала и требует перепостановки, начиная с
этапа отбора клинического материала.
ПРОБЛЕМЫ ПРИ РАБОТЕ И МЕТОДЫ ИХ УСТРАНЕНИЯ
| Проблема | Возможная причина | Решение |
| Нет сигнала по каналу FAM/Green | Использование неподходящих расходных материалов | Используйте оптические пробирки для поста-новки ПЦР, рекомендованные фирмой-произво-дителем амплификатора либо адаптированные для используемого прибора |
| Нет сигнала по каналу FAM/Green | Некачественно отобранный клинический материал | Разведите образец в 5 раз в воде, свободной от РНКаз и повторите анализ. |
| Нет сигнала по каналу FAM/Green | Некачественно отобранный клинический материал | провести повторный забор клинического материала |
| Нет сигнала по каналу FAM/Green | Некачественно отобранный клинический материал | используйте другой метод выделения РНК |
| Нет сигнала по каналу FAM/Green | Некачественно отобранный клинический материал | Проверьте состав транспортной среды |
| Нет сигнала в К+ | Некорректное приготовление ПЦР-смеси | аккуратно приготовьте новую ПЦР-смесь |
| Нет сигнала в К+ | Некорректные параметры амплификации | установите параметры амплификации в соответствии с таблицей 2 |
| Нет сигнала в К+ | Некорректные условия хранения наборов | используйте наборы, которые хранились в надлежащих условиях |
| Наличие сигнала по каналу НЕХ/Yellow в К- и/или ОКЭ | Контаминация | – проведите деконтаминационные процедуры; – используйте новые наборы |
ТРАНСПОРТИРОВКА И ХРАНЕНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ
– Транспортировка тест-системы осуществляется при температуре окружающей среды, но не выше 37 °С (до 5 суток) или при температуре +2–8 °С (до 30 суток). Допускается транспортировка любым видом транс-порта в условиях, обеспечивающих сохранность, в соответствии с правилами перевозки грузов, действующими на данном виде транспорта.
– Тест-систему хранят в упаковке изготовителя при температуре от –24 °С до –16 °С.
– Допускается заморозка/оттаивание компонентов тест-системы до 10 раз.
– Срок годности тест-системы «HALO SARS-2» – 12 месяцев с даты изготовления.
